2-8℃

1.蛋白酶抑制劑未開蓋使用前也可以2-8℃儲存。開蓋使用后-20℃儲存。
2.蛋白酶抑制劑在2-8℃低溫時是固體狀態，從冰箱取出后恢復至室溫或37℃短時間水浴，變成液體狀態后離心至管底部再開蓋。
3.試劑拆封后請盡快使用完！

一年

WB,IP等

動物細胞/組織

1.使用方便，從細胞，組織中提取蛋白不需經過研磨、反復凍融、超聲破碎等前處理。
2.提取過程簡單方便。
3.含蛋白穩定劑，提取的蛋白穩定。
4.紫外檢測蛋白濃度時，背景干擾低。
5.蛋白提取液含多種有效成分，可以充分釋放胞漿蛋白和膜蛋白，又可結合釋出的蛋白防止沉淀。
6.蛋白酶抑制劑抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制劑配方優化。蛋白酶抑制劑混合物包含6種獨立的蛋白酶抑制劑AEBSF、Aprotinin、Leupeptin、Pepstatin A、Bestatin、E-64，每一種抑制劑可特異性抑制某一種或幾種蛋白酶活性。該混合物優化的組成使其可以抑制幾乎所有重要的蛋白酶活性，包括蛋白酶、半蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。

WB,IP等

1.離心機
2.振蕩器
3.勻漿機/勻漿器
4.渦旋混勻器
5.移液器
6.冰箱
7.冰盒

1.PBS緩沖液
2.蛋白定量試劑盒

1.離心管
2.吸頭
3.一次性手套

使用注意事項：
? 旋帽離心管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內壁上的液體甩至管底，避免開蓋時液體灑落。
? 實驗過程中的所有試劑須預冷；所有器具須放-20℃冰箱預冷。整個過程須保持樣品處于低溫。
? 蛋白酶抑制劑儲存期間溶液如果出現沉淀，不影響使用，溶解后正常使用。
? 可以根據自己實驗需要加入其它蛋白酶抑制劑單品。
? Western實驗內參可以選用Tubulin、Na-K ATPase。
? 提取液A在使用前須一直置于2-8℃條件，否則下游膜蛋白提取時會導致不容易分層。
? 膜蛋白電泳時loading buffer應該避免煮沸。
? 膜蛋白電泳時可以提高loading buffer的SDS含量。

A． 細胞蛋白提取
1. 提取液準備：
每500 μl冷的蛋白提取液A中加入2 μl蛋白酶抑制劑混合物，2 μl蛋白穩定劑，混勻后置冰上備用。
每500 μl膜蛋白溶解液C中加入2 μl蛋白酶抑制劑混合物，混勻后置冰上備用。
2. 取5-10×106個以上細胞，在4℃，500×g條件下離心2-3分鐘，小心吸取培養基，盡可能吸干，收集細胞。
3. 用冷PBS洗滌細胞兩次，每次洗滌后盡可能吸干上清。
4. 細胞樣品中加入200 μl冷的試劑 A，高速渦旋振蕩5秒，置2-8℃振蕩30分鐘-1小時。
5. 再次高速渦旋振蕩5秒，然后在4℃，13000×g條件下離心5分鐘。
6. 將上清吸入另一預冷的干凈離心管，37℃水浴10分鐘，37℃條件 2000g離心3分鐘，此時溶液分為兩層，下層約為20-50 μl。
7. 小心收集上層，即為胞漿蛋白。下層為膜蛋白。
8. 用150-200 μl冰冷的試劑B稀釋下層膜蛋白部分，混勻后冰浴2分鐘，然后37℃水浴5-10分鐘，37℃條件 500-2000g離心3分鐘，此時溶液分為兩層，下層約為20-50 μl。
9. 小心移除上層，用50-200 μl冰冷的試劑C溶解下層，即得膜蛋白。
10. 將上述蛋白提取物定量后分裝于-80℃冰箱保存備用或直接用于下游實驗。

B． 組織蛋白提取
1. 取適量組織樣本用刀盡可能剪碎，加入冷的蛋白提取液A，用組織勻漿機/勻漿器勻漿至無明顯肉眼可見固體，將勻漿吸入另一預冷的干凈離心管。
2. 按照細胞蛋白的提取方法的第3步驟往下操作即可。

1.蛋白濃度低？
膜蛋白豐度比較低，在條件允許的情況下，需要盡可能加大細胞的上樣量以提高膜蛋白濃度。
處理部分組織樣本時可能沒有裂解，導致蛋白濃度低。只要適當延長試劑A的處理時間即可。在持續振蕩的條件下處理，沒有振蕩器也可間隔幾分鐘用吸頭吹打混勻。

2.用什么方法定量蛋白？
建議用BCA法。不適合用Bradford法，因為試劑A中含有干擾Bradford法的組份，導致定量不準。如果已經進行過透析處理或者用脫鹽柱改換過緩沖體系，則可以用Bradford法定量。

3.提取的蛋白具有活性嗎？
本試劑盒不含有離子型去垢劑組份，不破壞蛋白的結構，沒有對蛋白質之間原有的相互作用的破壞，蛋白均保持其天然構象和活性。

4.膜蛋白電泳沒有條帶？
膜蛋白樣品通常濃度較低，電泳前一定要進行蛋白定量，以保證電泳是蛋白上樣量足夠。
膜蛋白提取好后，用溶解液充分溶解后，可以超聲處理一下，再進行蛋白定量。
蛋白加Loading buffer后可以不用煮沸，采用50℃保溫30分鐘。
蛋白Loading buffer中SDS終濃度含量可以提高至3%-10%。
有些樣品的膜蛋白含量太低，可以使用丙酮沉淀膜蛋白，再使膜蛋白溶解于上樣緩沖液中，一般可以跑出清晰的蛋白條帶。
電泳時采用低電壓低電流電泳。
膜蛋白豐度通常較低，有條件可以嘗試用銀染染色。

1.RuhanJiang, et al.
A study on the degradation efficiency of fluoranthene and the transmembrane protein mechanism of Rhodococcus sp. BAP-1 based on iTRAQ
Science of The Total Environment 2020 （IF=6.551）

2.YubinFeng, et al.
ATPR-induced differentiation and G0/G1 phase arrest in acute promyelocytic leukemia by repressing EBP50/NCF1 complex to promote the production of ROS
Toxicology and Applied Pharmacology 2019 （IF=3.585）

3.Cuilian Yu, et al.
Taishan Pinus massoniana pollen polysaccharide inhibits subgroup J avian leucosis virus infection by directly blocking virus infection and improving immunity
Sci Rep. 2017 （IF=5.228）

4.Xiaoyun Lin, et al.
Chimerically fused antigen rich of overlapped epitopes from latent membrane protein 2 (LMP2) of Epstein–Barr virus as a potential vaccine and diagnostic agent
Cellular & Molecular Immunology 2016 （IF=8.213）

5.Ge Zhao, et al.
Phage Display against Corneal Epithelial Cells Produced Bioactive Peptides That Inhibit Aspergillus Adhesion to the Corneas
PLoS ONE March 2012 | Volume 7 | Issue 3, （IF=4.411）

6.Lihong Liao, et al.
The Influence of Down-Regulation of Suppressor of Cellular Signaling Proteins by RNAi on Glucose Transport of Intrauterine Growth Retardation Rats
Pediatric Research 2011 Volume 69, Issue 6, pp 497-503 （IF=2.882）