2-8℃ 避光

開蓋后組份按要求條件保存。

6個月

分光光度計

血清血漿/全血/組織

分光光度計

1.分光光度計
2.臺式離心機
3.移液器
4.恒溫水浴鍋

1.蒸餾水

1.吸頭
2.一次性手套

1.旋帽離心管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體甩至管底，避免開蓋時液體灑落。
2.空白管、標(biāo)準(zhǔn)管一般只需做1-2只
3.在正式實驗前務(wù)必做預(yù)實驗摸索取樣濃度。取樣量及取樣濃度因樣品種類不同，其GSH-PX活力不一。根據(jù)酶的百分抑制率與酶的活力呈拋物線關(guān)系，各種測定樣品取樣量及取樣濃度不一樣，在每測定一種新的樣品前選擇一個取樣量及取樣濃度；
4.溶血液在室溫1小時內(nèi)活力不變，建議樣品稀釋后不超過1小時測試。
5.血樣要新鮮。肝素抗凝后放冰箱不超過48小時。
6.試劑A的瓶子要洗干凈，工作液現(xiàn)用現(xiàn)配。
7.GSH標(biāo)準(zhǔn)品要現(xiàn)用現(xiàn)配。
8.37℃水浴反應(yīng)時間5分鐘要準(zhǔn)確。
9.測定上清液當(dāng)天提取，當(dāng)天測定；

一、樣本制備：
血清、血漿樣本： 按常規(guī)方法制備，可以直接用于本試劑盒的測定，-20℃凍存。

二、試劑的配制

GSH工作液的配制：


全血GSH-PX活力測定

1、樣本處理
溶血液配制：
⑴ 取肝素抗凝全血20ul，用蒸餾水稀釋至1ml，配成1:49的溶血液；
鼠血10ul，用蒸餾水稀釋至1ml，配成1:99的溶血液。
⑵ 充分混勻，放置5分鐘直至玻璃管中的溶血液對光呈透明狀，方可進行檢測。
⑶ 配好的溶血液中GSH-PX活力只能保持45分鐘-60分鐘，室溫較低時可延長至120分鐘。抗凝全血可在2-8℃保存2-3天。
注：1、測溶血液中GSH-PX含量要注意樣品測試前紅細(xì)胞一定要充分溶血。
2、正式實驗前請先取1~2個樣本做預(yù)實驗；

2、GSH-PX酶活力測定：
⑴ 酶促反應(yīng)：（注：試劑A工作液提前在37℃預(yù)溫）


⑵ 顯色反應(yīng)：按下列配方和步驟進行

3、全血中GSH-PX的活力的計算：
⑴ 定義：每4ul全血在37℃反應(yīng)5分鐘，扣除非酶促反應(yīng)的作用，使反應(yīng)體系中GSH濃度降低1umol/L為一個酶活力單位。
⑵ 計算：
非酶管OD-酶管OD 1+X
GSH-PX酶活力= X標(biāo)準(zhǔn)液濃度（20umol/L）X 稀釋倍數(shù)（5X ）
標(biāo)準(zhǔn)管OD-空白管OD 1+49
注： 5：從酶促反應(yīng)表中反應(yīng)液0.5ml加試劑B2ml，在反應(yīng)液中為5倍稀釋，所以乘5.
X：為全血稀釋比例，例如1:99稀釋，X為99
1+49：溶血液為1:49稀釋時，取0.2ml檢測即等同于取樣量為4ul的全血。

4、溶血液的取樣濃度及取樣量的摸索舉例；
1.樣本來源：正常組新鮮大鼠尾部全血；
2.樣本前處理：分別用蒸餾水將大鼠全血按1：24、1:49、1:59、1:69、1:79、1:89、1:99、1:149、1:199的比例稀釋成一系列不同濃度的溶血液，分別取一系列不同濃度溶血液0.2ml按全血的測定操作表進行檢測。

5、計算舉例：
A: 取1:49溶血液0.2ml進行測定，測得非酶管OD值0.463，酶管OD值為0.228，標(biāo)準(zhǔn)管OD值為0.165，空白管OD值0.041，
酶活力=（0.463-0.228）/ (0.165-0.041) X 20 X 5 X 50/50 =189.52酶活力單位
B: 取1:149溶血液0.2ml進行測定，測得非酶管OD值0.451，酶管OD值為0.205，標(biāo)準(zhǔn)管OD值為0.165，空白管OD值0.041，
酶活力=（0.451-0.205）/ (0.165-0.041) X 20 X 5 X 150/50 =595.16酶活力單位

組織、線粒體、細(xì)胞膜GSH-PX活力測定

1、樣本處理
10%組織勻漿的制備：
⑴ 取組織塊200mg-1g，用冷生理鹽水漂洗，除去血液，濾紙拭干，稱重，放入5-10ml的小燒杯內(nèi)。
⑵ 用量筒量取9倍重量的預(yù)冷的勻漿介質(zhì)（pH7.4,0.01mol/L蔗糖，0.01mol/L Tris-HCl，0.0001mol/L EDTA2Na溶液）或生理鹽水。用移液器將總量2/3的勻漿介質(zhì)或生理鹽水移入燒杯。用眼科小剪刀盡快剪碎組織塊（天熱時小燒杯要放入冰水中）；
⑶ 將剪碎的組織倒入玻璃勻漿管中，再將剩余的1/3的勻漿介質(zhì)或生理鹽水用來沖洗殘余在小燒杯中的碎組織一起倒入玻璃勻漿管中進行勻漿（6-8分鐘）。充分磨碎，使組織勻漿化；也可使用組織搗碎機10000-15000r/min，研磨制成10%組織勻漿；
⑷ 將制備好的10%勻漿3000r/min離心10-15分鐘，取上清。

線粒體的制備：
取10%組織勻漿5-10ml，以1000-2000r/min離心10分鐘，取上清，8000-10000r/min離心15分鐘，沉淀為線粒體。

2、GSH-PX酶活力測定：
⑴ 酶促反應(yīng)：（注：試劑A工作液提前在37℃預(yù)溫）

⑵ 顯色反應(yīng)：按下列配方和步驟進行
↓
混勻。室溫靜置15分鐘，412nm處，1cm光徑比色杯，蒸餾水調(diào)零，測各OD值。

3、組織中GSH-PX的活力的計算：
⑴ 定義：每mg蛋白質(zhì)，扣除非酶促反應(yīng)的作用，使反應(yīng)體系中GSH濃度降低1umol/L為一個酶活力單位。
⑵ 計算：
非酶管OD-酶管OD
GSH-PX酶活力= X標(biāo)準(zhǔn)液濃度（20umol/L）X稀釋倍數(shù)（5）÷反應(yīng)時間
標(biāo)準(zhǔn)管OD-空白管OD

÷(取樣量X樣本蛋白濃度)

注： 1.從酶促反應(yīng)表中反應(yīng)液0.5ml加試劑B2ml，在反應(yīng)液中為5倍稀釋，所以乘5.
2.組織蛋白的測定：可以用BCA 或Bradford蛋白定量試劑盒進行蛋白濃度測定；
4、組織勻漿的取樣濃度及取樣量的摸索舉例；
（1）樣本來源：正常組小鼠肝組織，制備成10%肝勻漿上清，用生理鹽水稀釋成1%，待測；
（2）樣本前處理：分別用生理鹽水將1%肝勻漿稀釋成1.0%、0.5%、0.4%、0.3%、0.25%、0.2%、0.1%、0.05%一系列不同濃度的組織勻漿，分別取一系列不同濃度組織勻漿0.2ml按組織的測定操作表進行檢
5、計算舉例：
取0.25%小鼠肝組織勻漿0.2ml進行測定，測得非酶管OD值0.480，酶管OD值為0.172，標(biāo)準(zhǔn)管OD值為0.163，空白管OD值0.041，1%勻漿蛋白濃度0.910mg/ml，
酶活力=（0.480-0.172）/ (0.163-0.041) X 20 X 5 ÷（0.910÷4*0.2）=1109.71酶活力單位
測酶活力用0.25%勻漿，蛋白定量用1%勻漿，所以除以4.

血清、血漿GSH-PX活力測定

1、GSH-PX酶活力測定：
⑴ 酶促反應(yīng)：（注：試劑A工作液提前在37℃預(yù)溫）
⑵ 顯色反應(yīng)：按下列配方和步驟進行
2、血清中GSH-PX的活力的計算：
⑴ 定義：每0.1ml血清在37℃反應(yīng)5分鐘，扣除非酶促反應(yīng)的作用，使反應(yīng)體系中GSH濃度降低1umol/L為一個酶活力單位。
⑵ 計算：
非酶管OD-酶管OD
GSH-PX酶活力= X標(biāo)準(zhǔn)液濃度（20umol/L）X稀釋倍數(shù)（6）
標(biāo)準(zhǔn)管OD-空白管OD

X測試前稀釋倍數(shù)

注： 從酶促反應(yīng)表中反應(yīng)液0.4ml加試劑B2ml，在反應(yīng)液中為6倍稀釋，所以乘6.

4、血清（漿）的取樣濃度及取樣量的摸索舉例；
（1）樣本來源：正常組大鼠眼眶取全血，抗凝取血漿；
（2）樣本前處理：分別用生理鹽水將血漿按1:1、1:4、1:7、1:9、1:14、1:19一系列不同濃度的血漿，分別取一系列不同濃度血漿0.1ml按血清（漿）的測定操作表進行檢