2-8℃避光

1.長期不用可以-20℃保存。
2.Annexin V-Alexa Fluor 660染色液避免反復凍融。多次凍融會導致失效。
3.Annexin V-Alexa Fluor 660染色液需要長期保存時可以根據情況進行小量分裝后-20℃保存。
4.試劑拆封后請盡快使用完！

1年

1.流式細胞儀
2.激光共聚焦
3.熒光顯微鏡

1.懸浮細胞
2.貼壁細胞

1.方便：可用流式細胞儀或熒光顯微鏡檢測；
2.快速：1小時內即可完成實驗；
3.準確：能準確區分活細胞、凋亡細胞和壞死細胞，并計數各群細胞的比例。

1.流式細胞儀
2.激光共聚焦
3.熒光顯微鏡

1.流式細胞儀或熒光顯微鏡或激光共聚焦
2.離心機
3.移液器
4.冰箱
5.冰盒

1.PBS 緩沖液（pH7.4，實驗室常用的10mM磷酸緩沖鹽溶液（1X））
2.或者HBSS（Hank's Balanced Salt Solution）

1.離心管
2.吸頭
3.一次性手套
4.鋁箔

1.螺旋蓋微量試劑管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內壁上的液體收集至管底，避免開蓋時液體損失導致試劑量不夠用。
2.細胞處理需要小心操作,盡量避免人為的損傷細胞。離心力在不損失細胞的前提下盡可能小，重懸細胞是動作要輕柔，避免多次反復的激烈吹打。不用渦旋振蕩器。
3.Annexin V-FITC（等）和Propidium iodide（等）是光敏物質，在操作時請注意避光，盡量減少它們暴露在光下的時間。有必要時可以使用帶蓋子的冰盒或鋁箔紙避光。標記后將細胞保持在避光環境中。移液過程中短暫暴露在光線下（<30秒）是可以接受的。
4.由于細胞凋亡是一個快速和動態的過程，因此在染色后立即進行分析。
5.使用Annexin V-FITC（等） 試劑盒檢測凋亡需要針對活細胞。不要固定細胞，固定操作會對結果產生干擾。

樣品染色：
1. 離心收集懸浮細胞。離心機300-500×g力，2-8°C，離心時間5分鐘，棄培養基。
2. 用冷PBS洗滌細胞兩次。（300×g -400×g，2-8°C，離心時間5分鐘收集細胞）。
3. 用100 μl 1X Annexin V結合液懸浮細胞，濃度大約為1-5 X 106 cells/ml。
4. 在細胞懸浮液中加入5 μl Annexin V- Alexa Fluor 660染色液，加入1 μl NucGreen D染色液，輕輕混勻后于2-8°C避光條件下孵育15-30分鐘。
5. 加入400 μl PBS或1X Annexin V結合液，輕輕混勻。
6. 立即用流式細胞儀檢測。

流式細胞儀分析：
經處理過的細胞此時可以在流式細胞儀上分析。
按照常規的流式凋亡檢測的操作即可。
Annexin V- Alexa Fluor 660的熒光激發波長662 nm，發射波長682 nm；NucGreen D熒光激發波長502 nm，發射波長在526 nm。

上機檢測前，須用待測細胞制備質控樣本來設定流式細胞儀的熒光補償和設置十字門的范圍：
（I） 未進行其它熒光標記的細胞
① 空白管：陰性對照組細胞，沒有染色的細胞。不加Annexin V/ Alexa Fluor 660，NucGreen D。用于調節電壓。
② 單染管：有明顯凋亡的細胞，只加Annexin V/ Alexa Fluor 660染色。用于調節補償。
③ 單染管：有明顯凋亡的細胞，只加NucGreen D染色。用于調節補償
④ 檢測管：待測的處理細胞，加Annexin V/ Alexa Fluor 660，NucGreen D。用空白管和單陽管調節好電壓補償后，獲得所需要的流式數據。

（II） 有其它熒光標記的細胞
① 未標記其它熒光空白管：未標記其它顏色的細胞，陰性對照組細胞，沒有染色的細胞。不加Annexin V/ Alexa Fluor 660，NucGreen D。用于調節電壓。
② 有其它顏色的空白管：有其它顏色的對照組細胞，沒有染色的細胞。不加Annexin V/ Alexa Fluor 660，NucGreen D。用于調補償
③ 未標記其它熒光單染管：未標記其它熒光且有明顯凋亡的細胞，只加Annexin V/ Alexa Fluor 660染色。用于調節補償。
④ 未標記其它熒光單染管：未標記其它熒光且有明顯凋亡的細胞，只加NucGreen D染色。用于調節補償
⑤ 檢測管：待測的處理細胞，加Annexin V/ Alexa Fluor 660，NucGreen D。用空白管和單陽管調節好電壓補償后，獲得所需要的流式數據。

【注】：
? 具體流式設置按常規方法即可。請參照流式細胞儀說明書或咨詢儀器技術支持。

實驗過程中Annexin V染不上色或陽性率偏低。可能的原因如下：
1. 用于檢測的流式細胞儀/顯微鏡設置不當。調整使用正確的儀器設置。
2. 確定實驗中的誘導劑是否能產生凋亡。可通過設定確切凋亡誘導效果的陽性藥物對照來排除這一情況。
3. 細胞未啟動凋亡。重新確定誘導后凋亡啟動的時間點（時程實驗）。
4. 細胞數量偏少。增加細胞數量。
5. 貼壁細胞消化不當。Annexin V 跟PS 的結合需要Ca2+離子，結合液中含有Ca2+，EDTA 的消化會影響染色，建議使用無EDTA 的，或者消化后用PBS洗滌干凈。

實驗過程中陽性率偏高。可能的原因如下：
1. 用于檢測的流式細胞儀/顯微鏡設置不當。調整使用正確的儀器設置。
2. 細胞本身活力太差。實驗中發現未經誘導凋亡的對照細胞經染色后AnnexinV+/PI+雙陽性的細胞比例過高，造成這種結果的原因可能是細胞本身活力太差。建議用臺盼藍染色計算細胞的活力，臺盼藍拒染的細胞應大于95%。若活力偏低低，建議重新復蘇細胞，通常剛復蘇的細胞至少要傳代3 次以后才能進行實驗。

1.Hongjuan Li, et al.
Nucleus-targeted nano delivery system eradicates cancer stem cells by combined thermotherapy and hypoxia-activated chemotherapy
Biomaterials 2019 （IF=10.317）

2.Wei Bing, et al.
Programmed Bacteria Death Induced by Carbon Dots with Different Surface Charge
Small 2016 （IF=11.459）

3.Linchong Sun, et al.
cMyc-mediated activation of serine biosynthesis pathway is critical for cancer progression under nutrient deprivation conditions
Cell Research 2015 （IF=20.507） 4.Kerong Deng, et al.
Enhanced Antitumor Efficacy by 808 nm Laser-Induced Synergistic Photothermal and Photodynamic Therapy Based on a Indocyanine-Green-Attached W18O49 Nanostructure
Advanced Functional Materials 2015 （IF=16.836）

5.Wenqiao Zang, et al.
miR-663 attenuates tumor growth and invasiveness by targeting eEF1A2 in pancreatic cancer
Molecular Cancer 2015 （IF=15.302）