-20℃保存

注意微生物污染

6個(gè)月

1. 離心機(jī)
2. 移液器
3. 冰箱
4. 冰盒

1.PBS緩沖液 2.HBSS

1. 離心管
2. 吸頭
3. 一次性手套

1. 注意無(wú)菌操作，盡量避免污染。
2. DNA不應(yīng)含有蛋白和酚。
3. 休克處理某些細(xì)胞系會(huì)使轉(zhuǎn)染效率大大提高，但應(yīng)注意甘油暴露過(guò)久易導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
4. 轉(zhuǎn)染12～24h后，可以加入終濃度為10mmol/L的丁酸鈉溶液，可以提高病毒滴度。
5. BBS Solution的pH值直接關(guān)系到轉(zhuǎn)染效率，盡量避免長(zhǎng)時(shí)間暴露在空氣中，以免被空氣中的二氧化碳酸化。
6. 轉(zhuǎn)染時(shí)，把DNA-氯化鈣溶液加入到BBS溶液中，不要把BBS溶液加入到DNA-氯化鈣溶液中。
7. 高純度的質(zhì)粒是獲得高轉(zhuǎn)染效率的必要條件，要確保A260/A280大于1.8，并且電泳檢測(cè)抽提到的質(zhì)粒90%以上都是超螺旋。
8. 在用磷酸鈣法轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)應(yīng)使用濃度不高于5%的二氧化碳，二氧化碳的濃度為3%左右。
9. 轉(zhuǎn)染時(shí)由于質(zhì)粒不同、細(xì)胞不同，的質(zhì)粒用量需自行摸索。

貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)染：
1. 在轉(zhuǎn)染前24h用消化培養(yǎng)細(xì)胞，取適量對(duì)數(shù)期細(xì)胞轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)器皿中，待細(xì)胞密度大70～80%滿時(shí)即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。后續(xù)操作步驟均按6孔板計(jì)算，如果轉(zhuǎn)染器皿不同，請(qǐng)按比例自行調(diào)節(jié)用量。
2. 在加入DNA之前2～4h，加入2ml不含抗生素的培養(yǎng)液，置于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
3. 取DNA(體積不宜超過(guò)20μl)加入100μl Calcium chloride solution，混勻，即為DNA-CaCl2溶液。
4. 取BBS solution 100μl，用移液器一邊吹打BBS solution，一邊逐滴加入DNA-CaCl2溶液(操作緩慢，一般在1～2min)。
5. 室溫靜置20～30min，即為DNA-CaCl2-BBS溶液，此時(shí)可能出現(xiàn)極其微小顆粒沉淀。
6. 取DNA-CaCl2-BBS溶液底部物質(zhì)均勻加入到6孔板細(xì)胞中，輕輕晃動(dòng)混勻。
7. 置于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
8. 去除培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞2次，加入2ml培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，一般24h后可見(jiàn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的表達(dá)。

懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)染：
1. 低速離心收集懸浮細(xì)胞，用PBS洗滌1次。
2. 取DNA(體積不宜超過(guò)20μl)加Calcium chloride solution，混勻，即為DNA-CaCl2溶液。
3. 取BBS solution，用移液器一邊吹打BBS solution，一邊逐滴加入DNA-CaCl2溶液。
4. 室溫靜置，即為DNA-CaCl2-BBS溶液，此時(shí)可能出現(xiàn)極其微小顆粒沉淀。
5. 每106個(gè)細(xì)胞沉淀用100μl DNA-CaCl2-BBS溶液重新懸浮室溫放置。
6. 6孔板每孔加入2ml不含抗生素的培養(yǎng)基，取DNA-CaCl2-BBS溶液底部物質(zhì)均勻加入到6孔板中，輕輕晃動(dòng)混勻。
7. 置于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，去除培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞2次，加入2ml培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，一般24h后可見(jiàn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的表達(dá)。