蛋白提取是分子生物學和生物化學研究中的基礎操作，不同定位的蛋白(總蛋白、核蛋白、膜蛋白)因結構和存在部位差異，提取方法有所不同，以下結合試劑盒的標準化操作流程及關鍵注意事項詳細說明：
 

　　總蛋白提取：總蛋白提取旨在獲取細胞或組織中所有蛋白，適用于大多數蛋白定性、定量及后續電泳、免疫印跡等實驗。
 

　　實驗前準備
 

　　試劑預處理：取出試劑盒中的裂解液，按比例加入蛋白酶抑制劑(避免蛋白降解)和磷酸酶抑制劑(如需保留磷酸化蛋白)，冰上預冷。
 

　　樣品處理：細胞樣品經 PBS 洗滌 2 次，去除培養基殘留；組織樣品需在液氮中研磨成粉末，避免常溫下蛋白降解。
 

　　提取步驟
 

　　加樣裂解：向細胞沉淀或組織粉末中加入預冷的裂解液(每 10^6 個細胞加 100-200μL，每 10mg 組織加 200-300μL)，渦旋振蕩 10-15 秒，冰上靜置 30 分鐘，期間每 10 分鐘渦旋一次，充分裂解細胞。
 

　　離心分離：4℃、12000-15000g 離心 10-15 分鐘，取上清液，即為總蛋白提取液。
 

　　關鍵注意事項
 

　　全程保持低溫操作(0-4℃)，抑制蛋白酶活性。
 

　　裂解液需與樣品充分混合，避免局部濃度過高影響裂解效果。
 

　　離心后避免觸碰沉淀(含細胞碎片、核酸等雜質)，確保上清純度。
 

　　核蛋白提取：核蛋白位于細胞核內，提取需先分離細胞核與細胞質，再裂解核膜釋放核蛋白，核心是避免細胞質蛋白污染。
 

　　實驗前準備
 

　　試劑預處理：核蛋白試劑盒通常含細胞質裂解液(低滲緩沖液)和核裂解液，均需加入蛋白酶 / 磷酸酶抑制劑，冰上預冷。
 

　　樣品處理：細胞經 PBS 洗滌后，離心收集沉淀，避免反復吹打損傷細胞核。
 

　　提取步驟
 

　　細胞質分離：向細胞沉淀中加入預冷的細胞質裂解液，冰上孵育 10-15 分鐘，期間輕輕彈擊管壁數次，使細胞膜破裂。4℃、5000g 離心 5 分鐘，收集上清液(細胞質蛋白)，保留沉淀(細胞核)。
 

　　細胞核洗滌：向細胞核沉淀中加入少量細胞質裂解液，輕輕吹打洗滌，離心后棄上清，去除殘留的細胞質蛋白。
 

　　核蛋白裂解：向洗滌后的細胞核沉淀中加入核裂解液，冰上孵育 20-30 分鐘，期間頻繁渦旋振蕩，促進核膜破裂。4℃、12000g 離心 10 分鐘，取上清液，即為核蛋白提取液。
 

　　關鍵注意事項
 

　　細胞質裂解液孵育時間需嚴格控制，避免過度裂解導致細胞核破裂，引發細胞質蛋白污染。
 

　　細胞核洗滌步驟不可省略，可根據污染情況重復 1-2 次。
 

　　核裂解液黏度較高，離心后需快速吸取上清，避免沉淀復溶。
 

　　膜蛋白提取：膜蛋白鑲嵌或附著于生物膜上，含大量疏水結構域，常規裂解液難以溶解，需借助去垢劑(如 Triton X-100、SDS 等)破壞膜結構。
 

　　實驗前準備
 

　　試劑預處理：膜蛋白試劑盒的裂解液含特定比例的去垢劑(兼顧溶解膜蛋白與保持蛋白活性)，加入抑制劑后冰上預冷。
 

　　樣品處理：細胞或組織樣品需充分破碎(如超聲破碎儀處理細胞，組織研磨時加入石英砂)，暴露細胞膜結構。
 

　　提取步驟
 

　　加樣裂解：向破碎后的樣品中加入膜蛋白裂解液，冰上孵育 40-60 分鐘，期間每 15 分鐘渦旋一次，使去垢劑充分作用于膜結構。
 

　　離心純化：4℃、10000g 離心 10 分鐘，去除未破碎的組織或細胞碎片；取上清液再次 4℃、15000g 離心 20 分鐘，進一步去除雜質，最終上清即為膜蛋白提取液。
 

　　關鍵注意事項
 

　　去垢劑濃度需嚴格遵循試劑盒說明，過高可能導致蛋白變性，過低則無法有效溶解膜蛋白。
 

　　樣品破碎程度直接影響提取效率，需根據樣品類型調整破碎參數(如超聲功率、研磨時間)。
 

　　膜蛋白提取后需盡快進行后續實驗，避免去垢劑失效導致蛋白沉淀。