線粒體、溶酶體、外泌體的提取均屬于亞細胞結構或胞外囊泡的分離純化技術，因各自的結構特性、存在環境差異，提取過程中需重點控制純度、完整性及活性(或功能性)，以下是三類物質提取的核心注意事項：
 

 

　　線粒體是胞內雙層膜細胞器，提取核心是分離線粒體與細胞質、細胞核等成分，同時避免膜結構破裂導致功能喪失。
 

　　樣品處理與前期準備
 

　　全程低溫操作(0-4℃)，抑制線粒體酶活性喪失及結構降解，所有試劑、離心管、研磨器材需提前冰上預冷。
 

　　樣品需新鮮：細胞或組織樣品采集后立即處理，避免常溫放置；組織樣品需在液氮中快速研磨成粉末，加入預冷的線粒體分離緩沖液(含蔗糖等滲透壓調節劑)，防止線粒體因滲透壓失衡破裂。
 

　　加入保護劑：在緩沖液中添加蛋白酶抑制劑(避免線粒體蛋白降解)和抗氧化劑(如谷胱甘肽，減少活性氧對線粒體的損傷)。
 

　　分離與純化過程
 

　　控制破碎強度：細胞破碎需采用溫和方式(如玻璃勻漿器手動勻漿、低功率超聲)，避免過度破碎導致細胞核、溶酶體破裂污染，同時確保線粒體完整釋放。破碎后可通過光學顯微鏡觀察，確保大部分細胞破碎且線粒體形態正常。
 

　　梯度離心參數精準：線粒體分離常用差速離心法，需嚴格控制離心轉速和時間(如先低速離心去除細胞碎片和細胞核，再高速離心收集線粒體沉淀)，后續可通過密度梯度離心(如蔗糖梯度、 Percoll 梯度)進一步純化，去除細胞質蛋白和其他細胞器污染。
 

　　避免反復凍融：收集的線粒體沉淀需用預冷的保存緩沖液重懸，短期 4℃保存(不超過 24 小時)，長期需分裝后 - 80℃凍存，禁止反復凍融破壞膜結構。
 

　　純度與活性驗證
 

　　純度檢測：通過 Western Blot 檢測標志物，線粒體陽性標志物(如細胞色素 c 氧化酶 IV、線粒體熱休克蛋白 60)，陰性標志物(如核蛋白標志物組蛋白 H3、細胞質蛋白標志物 GAPDH)，確保無明顯交叉污染。
 

　　活性驗證：若需后續功能實驗，需檢測線粒體呼吸鏈酶活性或膜電位，確認提取的線粒體保持生物學活性。
 

 

　　溶酶體是含酸性水解酶的單層膜細胞器，提取關鍵是維持其酸性環境和膜穩定性，避免水解酶釋放導致自身降解及樣品污染。
 

　　樣品與試劑準備
 

　　緩沖液選擇：使用含酸性調節劑(如檸檬酸 - 磷酸緩沖液，pH 4.5-5.5)和滲透壓穩定劑(如甘露醇、蔗糖)的專用緩沖液，模擬溶酶體內酸性環境，防止膜破裂。
 

　　抑制劑添加：除蛋白酶抑制劑外，需加入溶酶體酶抑制劑(如氟化鈉、焦磷酸鈉)，抑制溶酶體內部水解酶活性，避免其釋放后降解其他蛋白或自身結構。
 

　　樣品新鮮度：細胞或組織需即時處理，溶酶體對溫度敏感，常溫下易破裂，全程嚴格低溫操作。
 

　　分離純化關鍵步驟
 

　　溫和破碎細胞：采用手動勻漿或低強度超聲破碎，避免高壓導致溶酶體膜破裂，破碎后盡快離心分離，減少水解酶暴露時間。
 

　　優化離心方案：通過差速離心初步分離后，采用密度梯度離心(如蔗糖梯度離心，濃度梯度 15%-40%)純化，溶酶體因密度較高會處于特定梯度層，需精準收集目標層。
 

　　避免 pH 波動：所有操作中避免緩沖液與堿性溶液接觸，防止 pH 升高破壞溶酶體膜穩定性，收集的溶酶體沉淀需用酸性保存緩沖液重懸。
 

　　質量驗證與保存
 

　　純度檢測：檢測溶酶體標志物(如酸性磷酸酶、組織蛋白酶 D)，排除線粒體、細胞核等雜質污染。
 

　　保存條件：短期 4℃保存不超過 12 小時，長期需分裝后 - 80℃凍存，且需加入足量酶抑制劑，解凍后盡快使用。
 

 

　　外泌體是細胞分泌的納米級胞外囊泡(直徑 30-150nm)，提取核心是提高回收率，同時去除蛋白 aggregates、脂蛋白等雜質。
 

　　樣品預處理
 

　　樣品選擇：常用細胞培養液、血清、血漿、尿液等，血清 / 血漿樣品需先去除凝血因子和細胞碎片(5000g 離心 10 分鐘)，避免干擾后續分離。
 

　　避免污染：所有器材需滅菌處理，細胞培養液需使用無外泌體血清(通過超速離心預處理去除血清中的外泌體)，防止外源囊泡污染。
 

　　提取方法與操作細節
 

　　方法適配：根據樣品類型選擇試劑盒(如聚合物沉淀法、超速離心法、免疫親和法)，聚合物沉淀法操作簡便但純度較低，超速離心法純度高但對設備要求高，免疫親和法特異性強但產量較低。
 

　　超速離心參數：若采用超速離心法，需嚴格控制轉速和時間(如先 10000g 離心 30 分鐘去除大顆粒雜質，再 100000-120000g 離心 70-90 分鐘收集外泌體沉淀)，離心過程中保持溫度 4℃，避免囊泡結構破壞。
 

　　避免反復離心：多次高轉速離心可能導致外泌體破裂，沉淀重懸時需用預冷的 PBS 緩慢吹打，避免劇烈振蕩。
 

　　純度驗證與保存
 

　　純度檢測：通過透射電鏡觀察外泌體典型杯狀結構，納米顆粒追蹤分析(NTA)檢測粒徑分布，Western Blot 檢測外泌體標志物(如 CD63、CD81、TSG101)。
 

　　保存條件：短期 4℃保存不超過 3 天，長期需分裝后 - 80℃凍存，加入蛋白酶抑制劑，避免反復凍融導致囊泡破裂和蛋白降解。